众所周知，CRISPR-Cas9作为一项基因编辑技术，目前已经是生命科学领域家喻户晓的技术了。但虽说这项技术非常火爆，仍有许多同学对基因编辑技术存在理解偏差，比如最常见的，在应用CRISPR-Cas9构建基因敲除（KO）细胞系，到底采用质粒法、病毒法还是有其他更好的方法呢？

 

★慢病毒法★

 

指通过包膜蛋白与细胞表面受体结合的方式感染细胞。即慢病毒与宿主细胞膜融合后释放结构蛋白、酶蛋白和病毒基因组。病毒RNA在逆转录酶的作用下逆转录并与整合酶形成整合前复合物。整合前复合物进入细胞核后，整合酶催化其整合至宿主基因组。具体方法是将包装质粒、穿梭质粒和包膜质粒共转293T细胞，转染后48-72 h收集病毒上清，通过离心、过滤、浓缩、分装和滴度检测，进而感染靶细胞。此方法会引入外源基因，影响其他基因表达，并且存在脱靶效应。

 

图1.慢病毒法原理图

 

但是，慢病毒感染存在着两个比较关键的问题：

 

1. 利用慢病毒法转染Cas9会在敲除靶基因的同时引入新的基因，而且慢病毒转染的外源基因是随机整合，存在影响其他基因表达的风险。

 

2. CRISPR-Cas9编辑过程存在脱靶效应，慢病毒法会持续表达Cas9蛋白，长期存在的Cas9蛋白会对这种脱靶效应有累积效应，最终影响实验的严谨性。

 

图2. 慢病毒感染进行基因敲除

 

★质粒法★

 

将Cas9和sgRNA表达载体，通过瞬时转染的方式感染靶细胞，在细胞内翻译出Cas9蛋白，与转录的sgRNA结合，进入细胞核对基因组进行编辑。具体方法是将转染质粒和转染试剂混合，室温静置，转染体系加入靶细胞培养，再进行单克隆筛选、单克隆扩增、qPCR检测等。由于质粒整合到基因组的概率很低，随着细胞传代质粒载体会逐渐消失，感染效率逐渐降低。

图3.质粒法原理图

 

★RNP法★

 

与质粒法不同的是，RNP法是通过电刺激转染的方法直接将Cas9蛋白和sgRNA复合物转染到细胞中。由于Cas9蛋白是不带电荷的，而sgRNA是带电荷的，因此只有当Cas9与sgRNA结合后，才能更高效的将两者转染到细胞中。同时，由于Cas9和sgRNA会被降解，Cas9-sgRNA复合物在细胞内的存留时间不会很长，因此发生脱靶的概率很低，但相应的切割效率也可能有一定降低。

 

图4.RNP转染原理图

 

 

图2. Cas9蛋白与gRNA形成RNP复合物

 

从国内外文献报道的情况来看，质粒法和RNP法是目前主流的基因敲除策略，对于课题组实验室而言，质粒法可能更容易实施，而对于生物技术企业，RNP法则具有更高的实验效率。但这两种不同的方法只是殊途同归，只要能达到敲除效果的就是好方法。

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